Dipartimento per la formazione superiore e per la ricerca<br /> Direzione Generale per il coordinamento, la promozione e la valorizzazione della Ricerca Dipartimento per la formazione superiore e per la ricerca<br /> Direzione Generale per il coordinamento, la promozione e la valorizzazione della Ricerca

Denominazione	Rappresentante legale	Indirizzo sede legale	Sito web	E-mail	Telefono
Università degli Studi di FOGGIA	Lorenzo LO MUZIO	Via Gramsci, 89/91 71122 FOGGIA	http://www.unifg.it	rettorato@unifg.it	338446-338448

Denominazione del Centro di spesa	Referente	Indirizzo sede operativa	E-mail	Telefono
SCIENZE MEDICHE E CHIRURGICHE	FOSCHINO BARBARO Maria Pia	VIALE LUIGI PINTO, N. 1 PRESSO OO/RR 71122 FOGGIA (FG)	mariapia.foschino@unifg.it	0881 588025

5. Sintetica descrizione dello stato dell’arte e delle collaborazioni eventualmente già in essere

La medicina personalizzata ha lo scopo di individuare gruppi di pazienti al fine di indirizzare con precisione le terapie che possano dare la migliore risposta ed il più alto grado di sicurezza. Mediante la possibilità di determinare per ciascun paziente la diagnosi più precoce, la determinazione del rischio e il trattamento ottimale, la medicina personalizzata promette di incrementare la cura della salute insieme all’abbassamento dei costi [1]. In particolare, la variabilità della risposta alla terapia deve tener conto della genetica individuale nonché di fattori epigenetici propri di ogni particolare tessuto od organo. La medicina personalizzata è pertanto inscindibile dalla generazione di modelli che tengano conto delle varianti geniche e dell’epigenetica [2,3].
La riprogrammazione cellulare consiste nella determinazione del fato cellulare in termini di citotipo mediante l’introduzione di geni che determinano uno stato simil-staminale [4,5]. La scoperta che permette di ottenere le cosiddette "induced pluripotent stem cells (iPSCs)", le quali possono differenziare virtualmente in tutti i citotipi dei tre foglietti embrionali, ha uno spettro vasto di applicazione, in medicina rigenerativa, screening di nuovi farmaci, immunologia e oncologia. Più in generale, la riprogrammazione cellulare permette di ottenere modelli in vitro che possono essere generati da un individuo con la propria genetica ed epigenetica e quindi permettere la valutazione di fenomeni fisiopatologici e di risposta alla terapia quanto più personalizzata possibile [6].
La fibrosi cistica (FC) è caratterizzata dal coinvolgimento di molti organi, anche se la principale morbilità e mortalità è determinata dalla malattia polmonare, ed è dovuta alle mutazioni del gene CFTR. Oltre ad una mancanza di corrispondenza del fenotipo respiratorio in relazione allo stesso genotipo, i pazienti FC presentano una risposta variabile ai nuovi farmaci che correggono il difetto di base e che sono stati recentemente introdotti nelle terapie in uso [7]. La linea di ricerca proposta mira allo sviluppo di nuovi modelli di FC basati sulla riprogrammazione cellulare al fine di implementare lo screening di vecchi e nuovi farmaci in modo personalizzato e con precisione sempre maggiore. A tal fine, le iPSCs, ottenute dalla conversione di linfomonociti circolanti dei pazienti con FC, verranno indirizzate verso la generazione di epiteli delle vie respiratorie prossimali su cui i farmaci verranno testati. Tale linea di ricerca capitalizza su di attività di ricerca già svolte nel nostro Dipartimento riguardo a terapie cellulari e molecolari ed in particolare su tale malattia. L’utilizzo di cellule staminali mesenchimali ottenute da membrana amniotica ai fini del trattamento dei difetti di base delle cellule epiteliali respiratorie [8-10], nonché la capacità di correggere il difetto genico mediante vettori cromosomali [11], ha una notevole importanza per l’expertise conseguita. Tale lavoro si svolge in collaborazione con i seguenti partners: Prof.ssa Carla Colombo, Centro di Riferimento della Fibrosi Cistica della Lombardia, Milano; Prof.ssa Valeria Casavola, Dip. di Bioscienza, Biotecnologia e Biofarmaceutica, Università “A. Moro” di Bari; Prof.ssa Fiorentina Ascenzioni, Dip. di Biologia e Biotecnologia “C. Darwin”, Università “La Sapienza” di Roma.
[1] Vogenberg FR et al. Pharmacy & Therapeutics 2010;35:560-562, 565-567, 576.
[2] Garraway LA, Jänne PA. Cancer Discovery 2012;2: 214-226.
[3] Delhalle S et al. NPJ J Syst Biol Appl 2018;4:9.
[4] Nishikawa S et al. Nat Rev Mol Cell Biol 2008;9:725–729.
[5] Takahashi K, Yamanaka S. Cell 2006;126:663–676.
[6] Mou H et al. Ped Pulmonol 2015;50:S14-S23.
[7] Cholon DM, Gentzsch M. J Cyst Fib 2018;17:S52–S60
[8] Carbone A et al. Stem Cells Int 2018; 2018:1203717.
[9] Carbone A et al. J Cell Mol Med. 2014;18:1631-1643.
[10] Paracchini V et al. J Biomed Biotechnol 2012;2012:575471
[11] De Rocco D et al., Int J Mol Sci 2018;19:E1220.

6. Descrizione delle attività previste

Il principale obiettivo della linea di ricerca è quello di analizzare l'efficacia sia di farmaci già utilizzati in clinica e che di nuove molecole che agiscono sulla CFTR mutata in monolayers cellulari ottenuti sia a partire a) da induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs ) che b) da cellule nasali ottenute dalla mucosa nasale di pazienti affetti da Fibrosi Cistica.
a) Verranno generati modelli di epitelio respiratorio differenziato a partire dalle iPSCs ottenuto da pazienti FC. Il vantaggio di usare le iPSCs, convertite da cellule somatiche, è quello di avere una fonte inesauribile di cellule che possono essere poi utilizzate in vari saggi utili alla comprensione di alcuni aspetti fisiopatologici della malattia polmonare e, in questo contesto, la variabilità alla terapia farmacologica. Gli epiteli così generati potranno essere usati, paziente per paziente, per la verifica dell’efficacia di molecole già usate in clinica e di screening di nuovi farmaci che agiscono sulla CFTR mutata ed infine in interventi di terapia genica. Questo permetterà la comprensione dell’influenza della genetica e dell’epigenetica sul fenotipo polmonare ed un affinamento della terapia a livello personalizzato.
1) Conversione di cellule somatiche in progenitori di linea respiratoria: cellule mononucleate circolanti CD34+ saranno ottenute da pazienti con FC (in collaborazione con il Centro di Riferimento Regionale per la Fibrosi Cistica di Bari, con cui è in corso una collaborazione pluriennale) e incubate con vettori basati su Sendai virus ed esprimenti OSKM (Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc) (Thermo Fisher) [1] e mediante protocolli di conversione prima in endoderma definitivo, poi in endoderma intestinale anteriore ed infine in progenitori di linea respiratoria attraverso l’uso di piccole molecole e fattori di crescita [2]. La conversione nei diversi steps verrà controllata mediante real-time PCR (RT-PCR), citoflorimetria e microscopia confocale. Alla fine di questi passaggi, che durano circa 15 giorni, i precursori dovranno presentare una espressione di Nkx2.1 (marker di epitelio respiratorio).
2) Differenziazione dei progenitori in epitelio respiratorio: l’efficienza della conversione verrà saggiata funzionalmente e morfologicamente attraverso la formazione di sferoidi (chiamati anche organoidi) e di colture 3D su filtri semipermeabili che permettono la polarizzazione cellulare. Gli organoidi verranno formati seminando i progenitori su terreni semisolidi come il Matrigel per 14 giorni. Le colture 3D su filtri verranno coltivate per 4 settimane all’interfaccia con l’aria (air-liquid interface, ALI). In entrambi i tipi di coltura, verrà verificata la presenza di markers di linea respiratoria (Nkx2.1+, Sox9+), epiteliale (pan-citocheratina [KRT]+), delle giunzioni strette (ZO-1+), e di differenziazione dei progenitori nelle principali linee cellulari respiratorie: basali (TRP63+, KRT5+), ciliate (FOXJ1+), cellule club (CCSP+), e cellule ciliate (MUC5ac+). Gli organoidi e gli epiteli formati in ALI saranno inoltre studiati per l’espressione della CFTR e del canale epiteliale del sodio (ENaC), sia mediante RT-PCR che immunoistochimica.
3) Analisi della espressione funzionale di CFTR e di ENaC: Gli organoidi (vedi punto 2) possono essere utilizzati per lo studio della CFTR con un saggio di rigonfiamento (swelling assay) [3]. Negli organoidi, Infatti, la superficie interna è rivestita dalla porzione apicale delle cellule epiteliali, per cui la secrezione ionica e conseguentemente di acqua avviene verso l’interno inducendo un rigonfiamento. La forskolina, che agisce come agonista della CFTR, incrementa i livelli di cAMP e determina un aumento del volume degli organoidi .
Negli epiteli cresciuti in ALI, la funzionalità della CFTR verrà analizzata mediante un saggio spettroflurimetrico che utilizza la secrezione di un colorante fluorescente una volta caricato nelle cellule epiteliali. In entrambi i modelli la specificità dell’azione della CFTR verrà confermata con degli inibitori specifici per questa proteina canale [4]. L’analisi dell’assorbimento di fluido apicale, un indice della funzionalità dell’ENaC, verrà studiata negli epiteli in ALI mediante l’aggiunta di un liquido isotonico ed in presenza di camostat, un inibitore specifico di ENaC [5].
4) Generazione di iPSCs corrette con CRISPR/Cas9: questo obiettivo ha il fine di ottenere delle linee di iPSCs con FC corrette nella loro mutazione che verranno usate come linee isogeniche di controllo nei modelli organoidi ed ALI sopra descritti. Si darà priorità alla mutazione che più frequentemente si osserva in omozigosi nei pazienti FC, ovvero la F508del, ed alle mutazioni più rare, le quali sono orfane per la terapia con modulatori della proteina CFTR. La correzione della mutazione verrà eseguita mediante la tecnologia CRISPR/Cas9, utilizzando una piattaforma Thermo Fisher, che permette di transfettare le iPSCs con i componenti per l’editing genico e di arricchire le cellule che con successo sono state editate [1]. Le linee iPSCs corrette verranno quindi impiegate, insieme alle iPSCs parentali, nella generazione di organoidi e colture in ALI.
b) Colture primarie di epitelio nasale: I risultati ottenuti in epiteli formati in ALI ottenuti dalle iPSCs verranno confrontati con quelli ottenuti in monolayers di cellule epiteliali respiratorie nasali ottenute dagli stessi pazienti da cui sono stati isolate le cellule mononucleate circolanti per ottenere le iPSCs.
In tale maniera, si potranno giudicare se le caratteristiche fisiologiche della CFTR e dell’ENaC degli epiteli ottenuti da IPSCs sono funzionalmente sovrapponibili alle condizioni più prossime a quelle di un epitelio nativo quale la mucosa nasale . Le cellule nasali di pazienti con FC sia in terapia con correttori che in attesa di trattamento farmacologico verranno ottenute mediante una tecnica poco invasiva e poco dolorosa, ovvero brushing di entrambe le narici, in collaborazione con il Prof. Matteo Gelardi (Clinica Otorinolaringoiatrica, Università degli Studi di Bari) [6]. Le cellule verranno coltivate in un medium che ne permette l’espansione in presenza di un inibitore di Rho Chinasi (5 μM Y27632, Selleck Chemicals). Le cellule nasali dei pazienti verranno coltivate su filtri permeabili prima in colture sommerse e quindi in ALI in modo da formare dei monolayers polarizzati ciliati. In tali "epiteli "nasali di pazienti già in terapia verrà monitorato l'eventuale recupero dell'espressione funzionale della F508del CFTR mentre, negli epiteli nasali di pazienti in attesa di trattamento, verranno testate diverse combinazioni di correttori e potenziatori al fine di scegliere la combinazione di farmaci più appropriata per il paziente. Il recupero dell'espressione funzionale della F508del CFTR verrà valutato mediante immunofluorescenza e mediante saggi fisiologici di monitoraggio dell'attività della CFTR .quali la corrente di corto circuito (ISC) e la spettrofluorimetria in monolayers cellulari incubati con il fluoroforo sensibile alle variazioni della concentrazione di cloruro intracellulare [7,8].
La conversione delle iPSCs in epitelio respiratorio nei modelli di organoidi e ALI verrà svolta in collaborazione con la Dott.ssa Christine Bear, Hospital for Sick Children Hospital di Toronto (Canada), mentre il mantenimento ed il differenziamento delle cellule nasali saranno effettuati in collaborazione con il Dott. Luis Galietta, TIGEM, Pozzuoli (Napoli).
[1] Eckford PDW et al., J Cyst Fib 2018, in press.
[2] Wong AP et al. Nat Protoc 2015;10:363–381.
[3] Dekkers JF et al. Nat Med 2013;19:939–945.
[4] Guerra L et al., Eur Respir J 2015;46:558-561.
[5] Carbone A et al., J Cell Mol Med 2014;18:1631-1643.
[6] Gelardi M et al., J Biol Regul Homeost Agents 2018;32(1 Suppl. 1):37-40.
[7] Abbattiscianni et al. J Cell Sci. 2016 Mar 15;129(6):1128-40. 9
[8] Favia M. et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2014 307(1):L48-61.

7. Aspetti di coerenza della richiesta con l’area di specializzazione prevalente

La Fibrosi Cistica, oggetto di questa linea di ricerca, è la malattia più letale con ereditarietà autosomica recessiva tra la popolazione caucasica e non presenta una terapia risolutiva ma solo interventi palliativi. È pertanto necessario individuare dei trattamenti eziologici e che quindi, oltre a permettere una sopravvivenza maggiore, riducano l’alto costo a carico dei servizi sanitari nazionali (SSN). Il numero di pazienti FC nelle Regioni in ritardo di sviluppo o nelle regioni in transizione, oggetto del presente Avviso, sono circa 1441 (su un totale di 4981 in tutta Italia) [1], quindi la possibilità di individuare con precisione soggetti responsivi a nuovi farmaci, che costano anche circa 250.000 Euro/anno/paziente [2], può avere risvolti importanti per il SSN. Benché la mutazione più frequente in Italia sia la F508del (la cui prevalenza complessiva è del 68%), esistono molte altre mutazioni, la cui frequenza allelica è particolarmente elevata nelle Regioni sopra citate [3]. Pertanto, la linea di ricerca punterà a sviluppare le iPSCs in particolare a partire dai pazienti con queste mutazioni. Questo progetto si inscrive nel perimetro dell’area di specializzazione “Salute” in quanto ha come principale obiettivo la messa a punto di modelli di medicina rigenerativa, predittiva e personalizzata. I modelli paziente-specifici, ottenuti da iPSCs e da cellule nasali, permetteranno di stratificare gli individui in base alla risposta alle nuove terapie farmacologiche (medicina di precisione) e quindi di predirne l’effetto prima della somministrazione in vivo. Infine, la generazione di epiteli corretti a livello genetico permetterà di esplorare nuove ricerche mirate alla rigenerazione e riparazione degli epiteli polmonari in situ.
[1] Registro Italiano FC – Rapporto 2011-2014, Epidemiol Prev 2018;42 (Suppl 1):1-32.
[2] Lopes-Pacheco M, Front Pharmacol 2016; 7: 275.
[3] Dell’Edera D et al., Journal Med Case Rep 2014; 8:339.

8. Dotazione aggiuntiva di ricercatori a tempo determinato di linea 1 (Mobilità dei ricercatori)

8a - Tabella dei costi per i ricercatori di linea 1

	N. mesi fuori sede	Costo mesi fuori sede	Costo mesi in sede	Costo totale ricercatore linea 1
	TOTALE			0

9a – Dotazione aggiuntiva di ricercatori a tempo determinato di linea 2.1 "Attrazione dei ricercatori"

9b- Tabella dei costi per i ricercatori di linea 2.1

N. ricercatori	Costo mensile	Totale
1	5,405.46 €	194.596,56 €

9c – Dotazione aggiuntiva di ricercatori a tempo determinato di linea 2.2 "Attrazione dei ricercatori"

9d- Tabella dei costi per i ricercatori di linea 2.2

N. ricercatori	Costo mensile	Totale
0	5.405,46 €	0 €

10. Costo complessivo dell'attività di ricerca

Costo totale linea 1	0 €
Costo totale linea 2.1	194.596,56 €
Costo totale linea 2.2	0 €
TOTALE	194.596,56 €

4. Area di specializzazione prevalente tra quelle relative alla SNSI

Salute

5. Sintetica descrizione dello stato dell’arte e delle collaborazioni eventualmente già in essere

L’azione anti-cancro del sistema immunitario è stata dimostrata dalla letteratura degli ultimi decenni (1). Gli approcci di immunoterapia, infatti, rappresentano oggi un’importante opzione all’interno dell’armamentario terapeutico in oncologia. In particolare è ampiamente accettato che l’efficacia dell’immunoterapia sia in gran parte determinata dall’attività anti-tumorale della popolazione T linfocitaria effettrice citotossica (2). Tuttavia ad oggi i benefici dell’immunoterapia sono purtroppo limitati ad una frazione dei pazienti.
Le cellule tumorali stabiliscono un complesso rapporto con i tessuti circostanti (microambiente), che comprendono cellule parenchimali e stromali dell’organo in cui la neoplasia si sviluppa, nonché leucociti richiamati nella sede della lesione. Con la progressione del tumore, infatti, le cellule del microambiente rilasciano una serie di segnali i quali inducono cambiamenti profondi nel fenotipo delle cellule tumorali, e condizionano il trafficking delle cellule immunitarie. Il microambiente può attivamente inibire il reclutamento, l’adesione e l’attività di cellule T citotossiche anti-tumorali (3). Un obiettivo importante per lo sviluppo di approcci terapeutici di precisione è quindi rappresentato dall’individuazione di molecole fondamentali che possano contribuire alla migrazione di linfociti T effettori nei siti tumorali (4).
Insulin-like growth factor binding protein-6 (IGFBP-6) è una importante glicoproteina, membro della famiglia delle IGFBPs, che modula l'attività dei fattori di crescita IGFs. Di recente è stato dimostrato che IGFBP-6 esercita funzioni sia dipendenti che indipendenti da questi fattori (5). Tramite IGF-II, infatti, inibisce la proliferazione, la sopravvivenza e la differenziazione cellulare. In maniera indipendente dal sistema IGF, promuove l'apoptosi cellulare e inibisce l'angiogenesi. Nella sclerosi multipla, è stato dimostrato, invece, che un'aumentata espressione di IGFBP-6 favorisce il processo di demielinizzazione e quindi di processi infiammatori (5). Dati generati dal nostro gruppo dimostrano che IGFBP-6 si comporta come fattore chemottattico per linfociti T in pazienti affetti da artrite reumatoide, il quale rappresenta una patologia-modello di auto-immunità (6). Di assoluto interesse è la dimostrazione che l'esposizione a ipertermia di cellule dendritiche umane, causa sovraregolazione e secrezione di IGFBP-6, che a sua volta è responsabile della chemiotassi selettiva in vitro di monociti e di linfociti T (7). Infine IGFBP-6 ha effetti misurabili sui neutrofili (8). Sulla base di queste osservazioni, è assolutamente ragionevole ritenere che IGFBP-6 sia una proteina con un'importante funzione nell'attivazione del sistema immunitario (9). Dati preliminari generati del nostro gruppo hanno consentito la dimostrazione istologica della presenza di IGFBP-6 all’interno del microambiente tumorale, in pazienti neoplastici. Questo progetto propone l’individuazione e la caratterizzazione ulteriore del ruolo che la molecola IGFBP-6 svolge nel microambiente tumorale, nell’attivazione della risposta immune in vitro e in vivo nell’animale da esperimento. Tale lavoro si svolgerà sulla base di solide collaborazoni avviate da anni, con i seguenti partners: Prof. Roberto Gerli, Università di Perugia, Prof. Brunangelo Falini, Università di Perugia, Prof.ssa Teresa Marafioti, University College London, UK.

1. Zappasodi, R. Cancer Cell. 2018. 33:581-598.
2. van der Burg, SH. Semin Immunol. 2018. Apr 27. [Epub ahead of print]
3. Shiao, S.L. et al. Genes & Development 2011. 25:2559–2572.
4. Fridman, W.H. Nature Reviews Cancer 2012. 12:298-306.
5. Bach, L.A. Growth Horm IGF Res. 2016. 30-31: 81-86.
6. Alunno, A. et al Front Immunol. 2017. 8: 554.
7 Liso, A. et al , Oncotarget. 2017. 8:60826-60840.
8 Conese, M. et al, Inflamm Res. 2018. 67:107-109.
9 Liso, A. et al Journal of cellular and molecular biology, 2018 In press.

6. Descrizione delle attività previste

Obiettivi
Nello sviluppo di tutti gli approcci di immunoterapia anti-cancro è di fondamentale importanza che le cellule T effettrici possano raggiungere efficacemente ed in numero congruo il microambiente tumorale per poter controllare la proliferazione neoplastica. Recenti studi pubblicati dal nostro gruppo dimostrano che IGFBP-6 è sovraregolato nell’immunità e in particolare in cellule dendritiche dopo ipertermia. Inoltre IGFBP-6 agisce come amplificatore tardivo di attivazione nei neutrofili e come fattore chemotattico per i linfociti T, per i monociti e per i neutrofili, ma non per i linfociti B. Data la disregolazione nota del sistema IGF in patologie autoimmuni e nel cancro, tale proteina rappresenta un potenziale biomarker di attività del sistema immunitario in patologie tumorali.

Gli obiettivi del presente progetto sono:
1) caratterizzare il ruolo della proteina IGFBP-6 all’interno del microambiente tumorale sia in tumori solidi che ematologici. In particolare, il progetto analizzerà l’espressione istologica e sierica in pazienti neoplastici per valutare la correlazione con l’outcome e con la composizione istologica del microabiente tumorale, nei diversi casi.
2) caratterizzare ulteriormente le sottopopolazioni T linfocitarie chemoattratte da IGFBP-6 in vitro sia in soggetti sani che in soggetti affetti da patologie autoimmuni. Inoltre, è obiettivo del progetto misurare gli effetti, i tempi e modi del legame di IGFBP-6 con i recettori cellulari e le vie del segnale che esso attiva in cellule neoplastiche.
3) Infine ci si propone di analizzare gli effetti in vivo sull’animale da esperimento (IGFBP-6 è una proteina evolutivamente conservata) dell’inoculo della proteina ricombinante, valutando la chemiotassi in vivo, la capacità di infiltrazione di masse neoplastiche (generate dall’inoculo di linee singeniche sottocute) da parte delle cellule reclutate e le loro caratteristiche.

Metodi
1) Verranno collezionati non meno di cento campioni sierici e tissutali, comprese biopsie linfonodali di pazienti con metastasi, di soggetti affetti da patologie tumorali quali polmone, colon, mammella, linfomi, prostate, ovaio. I campioni sierici verranno processati per studi immunoenzimatici (ELISA e/o Luminex) in modo da rilevare e quantificare la glicoproteina presente. Le biopsie verranno processate in parte per reazioni di istologia e immunoistochimica e in parte omogeneizzate per studi di western blotting e real-time PCR. Utilizzando specifici anticorpi anti IGFBP-6, le fettine bioptiche verranno processate per reazioni di immunoistochimica e l'espressione della proteina nei diversi citotipi verrà valutata attraverso osservazioni al microscopio. Il livello trascrizionale e proteico di IGFBP-6 verrà quantificato utilizzando reazioni di immunoblotting e RT-PCR. Sono infatti disponibili in commercio anticorpi monoclonali e policlonali per vari applicazioni, già testati nei nostri precedenti studi (Ab135606 Abcam Anti-IGFBP6 antibody - C-terminal ; Ab135606 Abcam Rabbit pAb to IGFBP6). L’analisi istologica dell’espressione di IGFBP-6 verrà effettuata su campioni forniti dal laboratorio di Emopatologia dell’Università di Perugia (Prof. B. Falini) e dal laboratorio di anatomia patologica di UCL Hospital, London, UK (Prof. T. Marafioti).

2) 2a. Analisi dei fenomeni di chemotassi
La seconda fase contempla l’uso di proteina ricombinante IGFBP-6 umana già disponibile in commercio (Peprotech Recombinant human IGF-BP6). In particolare verrà testata l’entità della chemotassi in vitro come descritto dal nostro gruppo in precedenza utilizzando filtri semipermeabili con pori da 4 m (Liso, A. et al, Oncotarget 2017; 8:60826-60840). Verranno analizzate e quantificate le popolazioni cellulari che andranno incontro a migrazione per mezzo di citofluorimetria e di microscopia a fluorescenza e confocale avvalendosi dell'utilizzo di anticorpi specifici. Gli studi di migrazione in vitro per l’analisi delle sottopopolazioni T coinvolte verranno svolti anche su cellule murine. Gli studi chiariranno in che misura le popolazioni linfocitarie siano effettrici e/o regolatorie in diversi soggetti.

2b. Studi sugli effetti diretti esercitati da IGFBP-6 su cellule di tumore ovarico
L'espressione di IGFBP-6 è diminuita in un certo numero di cellule tumorali ed è stato dimostrato che IGFBP-6 può agire come soppressore del tumore. Il sistema IGF è implicato in particolare nel cancro ovarico; infatti, sia i ligandi IGF che il recettore IGF-I sono espressi in questa neoplasia (Bruchim I, Werner H. Expert Opin Ther Targets 2013;17:307–20.). È stato inoltre dimostrato che gli IGFs stimolano l'invasione, la proliferazione e l'angiogenesi delle cellule del cancro ovarico (Beauchamp, MC, et al, J Oncol 2010:257058).
Al fine di esplorare gli effetti diretti che la proteina ricombinante esercita su cellule neoplastiche analizzeremo gli effetti dell'IGFBP-6 sulle cellule dell’adenocarcinoma ovarico. Le linee cellulari utilizzate saranno di adenocarcinoma ovarico umano poco differenziato PEA1 (pretrattamento CDDP(Cis-platinum)) e Pea2 (dopo trattamento con CDDP) (Langdon SP, et al. Cancer Res 1988; 48:6166-72 ; Yang Z, Bach LA, Front Endocrinol 2015;5:231).
È noto che l’effetto chemiotattico è mediato dalle vie di segnalazioni cellulari delle MAP kinasi. Inoltre l’IGFBP-6 ha la capacità di entrare nel nucleo e modulare la sopravvivenza e la differenziazione cellulare. Le cellule verranno trattate, dopo un peiodo di 16 ore in basso siero, con la proteina ricombinante IGFPB6 e, tramite Western Blotting, valuteremo l’attivazione della fosforilazione di ERK1/2 e l’attivazione del pathway delle MAP chinasi. L’interesse è rivolto anche, nelle stesse linee cellulari di adenocarcinoma di ovaio, allo studio del RNA messaggero, confrontando i risultati con l’espressione della proteina e valutandone la congruità temporale. Tramite la tecnica di Real-time si valuterà, l’espressione genica di fattori trascrizionali a valle della via di segnalazione delle MAP chinasi come c-myc e c- fos.

3) La terza fase del progetto sarà incentrata sullo studio nel modello murino all’interno della animal facility dell’Università di Foggia su linee cellulari di tumori solidi fornite dal Prof. M. Landriscina, Cattedra di Oncologia dell’Università di Foggia. In dettaglio, dopo formazione di masse neoplastiche sottocutanee gli animali verranno incolulati con IGFBP-6 e successivamente sacrificati. Le sezioni delle biopsie verranno analizzate per mezzo di metodiche di immunoistochimica o di immunofluorescenza, utilizzando anticorpi specifici per marcatori di monociti, macrofagi, linfociti T. Lo stato flogistico sarà analizzato e quantificato. Inoltre, utilizzando doppia colorazione, verrà anche valutato se IGFBP-6 è espressa anche dalle stesse cellule infiammatorie. L'insieme delle fasi sperimentali permetteranno anche di valutare se vi è una eventuale correlazione tra grado di infiammazione ed espressione di IGFBP-6. Inoltre il raggiungimento degli obiettivi di questo studio contribuirà ad acquisire nuove informazioni circa le interazioni tra cellule neoplastiche e microambiente, e forniranno la base per schiarire il ruolo di IGFBP-6 come eventuale fattore pro-infiammatorio (chemiotattico) nella patologia neoplastica.

7. Aspetti di coerenza della richiesta con l’area di specializzazione prevalente

Nel corso degli ultimi anni sono stati sviluppati numerosi approcci di immunoterapia anti-cancro e che hanno permesso di conseguire importanti successi nel trattamento, ma purtroppo solo in una frazione di pazienti. Non sono ad oggi noti marcatori predittivi di efficacia, utili ai fini della personalizzazione del trattamento, né tutti i meccanismi che ostacolano gli approcci immunoterapici.
Di recente due approcci si sono rivelati particolarmente promettenti. Uno è fondato sull’uso di anticorpi monoclonali diretti contro bersagli che fanno parte dei cosiddetti check-point immunologici (e.g. CTLA-4 e PD1/PDL-1), l’altro è rappresentato dall'uso di linfociti CAR-T, cioè linfociti T chimerici ingegnerizzati in laboratorio.
Tuttavia una mole notevole di studi ha dimostrato che il microambiente tumorale può avere effetti deleteri influenzando l’evoluzione neoplastica e l’infiltrato cellulare associato, pur in presenza di terapie in grado di ri-orientare contro il cancro il potenziale di controllo e di distruzione T linfocitario. In particolare una caratterizzazione molecolare del microambiente può fornire informazioni preziose sia sul piano biologico che clinico.
I dati ad oggi disponibili suggeriscono che la glicoproteina IGFPB-6 possa potenzialmente svolgere un ruolo importante per il reclutamento dei linfociti T e fungere da biomarker di attivazione e del reclutamento di linfociti in numerose patologie tumorali. Il presente progetto utilizzerà un sofisticato approccio di analisi di modelli in vitro ed in vivo con l’obiettivo di studiare i meccanismi molecolari responsabili dell’azione della proteina e di validarne la eventuale ricaduta clinica. Lo studio di una molecola specifica, quale IGFBP-6, offre il potenziale applicativo dettato dalla presenza in commercio di anticorpi monoclonali diretti contro specifici epitopi della proteina, nonché modelli animali già disponibili ed ingegnerizzati per essere privi o sottoesprimenti la proteina.

8. Dotazione aggiuntiva di ricercatori a tempo determinato di linea 1 (Mobilità dei ricercatori)

8a - Tabella dei costi per i ricercatori di linea 1

	N. mesi fuori sede	Costo mesi fuori sede	Costo mesi in sede	Costo totale ricercatore linea 1
1.	6	5.405,46 €	4.805,46 €	176.596,56 €
	TOTALE			176.596,56 €

9a – Dotazione aggiuntiva di ricercatori a tempo determinato di linea 2.1 "Attrazione dei ricercatori"

9b- Tabella dei costi per i ricercatori di linea 2.1

N. ricercatori	Costo mensile	Totale
0	5,405.46 €	0 €

9c – Dotazione aggiuntiva di ricercatori a tempo determinato di linea 2.2 "Attrazione dei ricercatori"

9d- Tabella dei costi per i ricercatori di linea 2.2

N. ricercatori	Costo mensile	Totale
0	5.405,46 €	0 €

10. Costo complessivo dell'attività di ricerca

Costo totale linea 1	176.596,56 €
Costo totale linea 2.1	0 €
Costo totale linea 2.2	0 €
TOTALE	176.596,56 €

4. Area di specializzazione prevalente tra quelle relative alla SNSI

Salute

5. Sintetica descrizione dello stato dell’arte e delle collaborazioni eventualmente già in essere

Il carcinoma del colon-retto (CCR) è la terza causa di tumore e la seconda causa di morte per neoplasie in Italia [1]. In questo contesto ed in particolare nella malattia metastatica, la resistenza farmacologica è il principale fattore responsabile del fallimento dei trattamenti farmacologici [2]. Numerosi studi hanno individuato nuovi meccanismi molecolari responsabili della resistenza ai principali trattamenti antitumorali e validato clinicamente biomarcatori tumorali, prevalentemente mutazioni a carico dei geni RAS, che permettono di selezionare pazienti con tumori resistenti agli inibitori dell’EGFR. Non esistono invece marcatori predittivi di resistenza/sensibilità ai chemioterapici ed ai farmaci antiangiogenetici e sono necessarie nuove strategie per bypassare la resistenza ed offrire ai pazienti terapie personalizzate, cioè selezionate sulla base del profilo molecolare della singola neoplasia. E’ infatti dimostrato che l’avvento della medicina di precisione e delle terapie personalizzate rappresenta un strategia efficace per migliorare la prognosi dei pazienti con CCR, ridurre le tossicità dei farmaci e ottimizzare le risorse economiche.
Il nostro gruppo di ricerca è coinvolto da numerosi anni nello studio della caratterizzazione molecolare del CCR [3] e del ruolo del pathway dei chaperone molecolari della famiglia HSP90 nel determinare una condizione di resistenza ai farmaci antiblastici, quali l’oxaliplatino e l’irinotecan [4-6]. Questi studi hanno permesso di dimostrare che la cellula di CCR, sottoposta a condizioni di stress, upregola i chaperone molecolari HSP90 e questo determina, attraverso la regolazione di un network di proteine clienti, una riprogrammazione metabolica, della espressione genica e del signaling intracellulare ed una parallela condizione di resistenza all’apoptosi [7].
L’epigenetica è una braca della biologia che studia i meccanismi di regolazione dell’espressione genica basati su alterazioni non strutturali del DNA e delle proteine istoniche. In particolare, è stato dimostrato che eventi di metilazione e demetilazione dei geni comportano variazioni dell’espressione genica e che la cellula tumorale utilizza queste alterazioni per riprogrammare una serie di funzioni determinanti per il fenotipo neoplastico. In particolare, la regolazione epigenetica dell’espressione genica è responsabile della resistenza farmacologica al pari delle più note alterazioni geniche e dei meccanismi post-trascrizionali della regolazione dell’espressione genica e può essere studiata per individuare nuovi biomarcatori predittivi di resistenza [8]. Questo progetto propone quindi la caratterizzazione epigenetica dei CCR metastatici al fine di individuare una signature epigenetica di resistenza utilizzabile sul piano clinico per selezionare i farmaci a cui il singolo tumore ha maggiori probabilità di essere sensibile.
Il progetto verrà svolto presso il Laboratorio di Oncologia Medica dell’Università di Foggia in collaborazione con il Laboratorio di Medicina Preclinica e Traslazionale dell’IRCCS-CROB di Rionero che fornirà la tecnologia Illumina e Life Technology per l’analisi di metilazione e di espressione genica e garantirà la disponibilità dei campioni biologici conservati presso la Biobanca dei tumori solidi. Inoltre, lo studio verrà effettuato in collaborazione con l’U.O. di Oncologia Medica dell’Università Cattolica del S. Cuore che fornirà i campioni biologici di CCR e di metastasi epatiche.

[1] I numeri del cancro in Italia. AIOM-AIRTUM 2016
[2] Konieczkowski DJ et al. Cancer Cell. 2018;33(5):801-815.
[3] Maddalena F, et al. Oncotarget 2017;8(13):21229-21240.
[4] Maddalena F, et al Cancer Res 2011;71:59-7669.
[5] Condelli V, et al. Cancer Res. 2014; 74(22):6693-6704.
[6] Lettini G, et al. Cell Death Differ 2016;23(11):1792-1803.
[7] Lettini G, et al. Expert Opinion on Therapeutic Targets 2017, 21(8):805-815. I.F. 4.873.
[8] Gao D et al. Oncotarget. 2016;7(24):37331-37346.

6. Descrizione delle attività previste

Obiettivi. Il progetto si propone la caratterizzazione epigenetica del carcinoma del colon-retto (CCR) metastatico per studiarne il ruolo nella resistenza ai due chemioterapici maggiormente utilizzati, l’oxaliplatino e l’irinotecan ed agli anticorpi monoclonali anti-EGFR. Lo studio utilizzerà metodiche di analisi del profilo di espressione genica e di metilazione per individuare i geni differenzialmente espressi e differenzialemente metilati per caratterizzarne il ruolo nel processo della resistenza farmacologica. Il progetto partirà da linee cellulari di CCR umano resistenti ad oxaliplatino, irinotecan e cetuximab ed, in una seconda fase, prevede l’utilizzo di campioni umani di CCR e dataset pubblici al fine di validare i geni differenzialmente metilati come marcatori di resistenza. Il fine ultimo è la validazione di una lista di geni (signature molecolare) che permetta di predire la resistenza ai singoli trattamenti e di personalizzare le scelte terapeutiche.

Metodi. Lo studio utilizzerà modelli cellulari in vitro e modelli in vivo di CCR umano. Verranno utilizzate linee cellulari di CCR KRAS-mutate HCT116, BRAF-mutate HT29, RAS/BRAF-wild type NCI H508 e colonsfere selezionate da CCR umani con genotipi RAS/BRAF diversi. Le linee cellulari HCT116 ed HT29 resistenti ad oxaliplatino ed irinotecan e la linea cellulare NCI H508 resistente all’anticorpo anti-EGFR cetuximab e le colonsfere sono disponibili nel laboratorio. Verranno inoltre utilizzati i seguenti modelli in vivo: 1) campioni operatori di CCR metastatico primariamente resistenti o sensibili alla chemioterapia a base di oxaliplatino (schema FOLFOX, 20 pazienti) o irinotecan (schema FOLFIRI, 20 pazienti) o alla combinazione di chemioterapia con il cetuximab (40 pazienti), 2) 40 campioni di metastasi epatiche di CCR trattati con chemioterapia preoperatoria ed intervento di resezione delle metastasi (biopsie prechemioterapia e tessuto operatorio postchemioterapia), e 3) DNA tumorale circolante (ctDNA) ottenuto dagli stessi pazienti sottoposti a resezione delle metastasi epatiche. Il DNA verrà estratto dai tessuti operatori o dalle biopsie fissate in paraffina. I tumori primariamente resistenti sono stati già selezionati sulla base della evidenza radiologica di progressione di malattia dopo 3 mesi dall’inizio del trattamento. I gruppo di tumori primariamente resistenti verrà confrontato con un gruppo di controllo di CCR metastatici sottoposti ad analoga chemioterapia e con una sopravvivenza libera da progressione dopo terapia >12 mesi. I campioni di metastasi epatiche verranno selezionati in una fase successiva dello studio e verranno suddivisi in due sottogruppi: tumori che hanno ottenuto una risposta maggiore dopo chemioterapia (grado di regressione tumorale (TGR) 3-4 secondo la classificazione di Rubbia-Brandt et al, Ann Oncol. 2007;18(2):299-304) e tumori che non hanno ottenuto una risposta al trattamento (TGR 4-5) (20 pazienti circa per ogni sottogruppo). I pazienti sono stati e verranno ulteriormente selezionati presso le U.O. di Oncologia Medica del Policlinico Universitario Ospedali Riuniti di Foggia, dell’IRCCS-CROB di Rionero in Vulture e del Policlinico Universitario A. Gemelli dell’Università Cattolica del S. Cuore di Roma. L’analisi di metilazione e di espressione genica verranno effettuate mediante tecnologia Illumina e Life Technology.

Progetto. Il progetto prevede una prima fase in cui verranno studiati i modelli in vitro utilizzando le linee cellulari resistenti ai farmaci e le colonsfere dopo trattamento con i farmaci indicati. In particolare verranno studiate le linee cellulari HCT116 ed HT29 sensibili e resistenti a oxaliplatino o irinotecan e le colonsfere esposte a trattamento subcitotossico con gli stessi chemioterapici. Per lo studio della resistenza al cetuximab verranno utilizzate cellule NCI H508 sensibili e resistenti e colonsfere RAS/BRAF wild type esposte a trattamento prolungato con cetuximab. Le linee cellulari e le colonsfere saranno analizzate per il profilo di metilazione e di espressione genica con l’obiettivo di individuare i geni che sono differenzialmente regolati nelle cellule resistenti in quanto differenzialmente metilati. Le liste dei geni differenzialmente espressi e differenzialmente metilati verranno utilizzate per studiare, mediante analisi biostatistica, le funzioni biologiche ad essi associate al fine di caratterizzare i meccanismi biomolecolari regolati a livello epigenetico e responsabili della resistenza ai specifici farmaci.

La seconda parte del progetto prevede la caratterizzazione del profilo di metilazione di 40 CCR metastatici sottoposti a prima linea di terapia e primariamente resistenti ad uno dei due schemi di chemioterapia più comunemente utilizzati nel CCR (20 trattati con schema FOLFOX e 20 trattati con schema FOLFIRI) e 40 pazienti primariamente resistenti alla combinazione di chemioterapia e cetuximab. Il confronto verrà effettuato con un gruppo controllo di tumori sensibili sottoposti a terapie analoghe. Le liste di geni differenzialmente metilati nei tumori primariamente resistenti rispetto a quelli sensibili verranno sottoposte ad analisi biostatistica e confrontate con quelle ottenute nelle linee cellulari farmaco-resistenti e nelle colonsfere. Questa analisi permetterà di individuare:
a) Geni associati alla resistenza a singoli farmaci (oxaliplatino, irinotecan e cetuximab) derivati dai modelli in vitro (linee cellulari e colonsfere);
b) Geni associati alla resistenza al specifici schemi di chemioterapia (FOLFOX o FOLFIRI) o alla combinazione di chemioterapia e cetuximab derivanti dai tumori di pazienti primariamente resistenti;
c) Geni associati alla resistenza a singoli farmaci condivisi dai modelli in vitro ed in vivo.

Questi ultimi geni o, in mancanza di geni condivisi dai modelli in vitro ed in vivo, quelli derivanti dalle analisi al punto b verranno utilizzati come signature di metilazione predittiva di resistenza da validare ai fini dell’applicazione clinica. Questa validazione avverrà su una casistica di 40 campioni operatori di metastasi epatica sottoposti a chemioterapia preoperatoria e di cui verranno analizzati il DNA derivante dalla biopsia prechemioterapia e dal campione operatorio postchemioterapia. Questi pazienti verranno distinti in due sottogruppi: tumori che hanno ottenuto una risposta maggiore dopo chemioterapia (TGR 3-4) versus tumori che non hanno ottenuto una risposta al trattamento (TGR 4-5). L’analisi statistica permetterà di valutare l’arricchimento del profilo di metilazione nel sottogruppo dei tumori non responsivi al trattamento e questo permetterà di individuare un profilo di metilazione predittivo di resistenza.
Infine, lo studio prevede una terza fase in cui la signature di metilazione verrà valutato sul ctDNA ottenuto dal sangue periferico dei pazienti sottoposti a resezione delle metastasi epatiche. Questa analisi permetterà di confrontare il profilo di metilazione predittivo di resistenza sul DNA purificato dal sangue con quello purificato da materiale biologico. Questa analisi di fattibilità permetterà di validare su ctDNA la possibilità di utilizzo del profilo di metilazione di un panel di geni a fine predittivo. Inoltre, in caso di successo di questo progetto, verrà progettato un chip customizzato per l’analisi del panel di geni differenzialmente metilati e che potrà essere utilizzato in clinica.

7. Aspetti di coerenza della richiesta con l’area di specializzazione prevalente

Il CCR metastastico è una patologia ad elevata mortalità con una sopravvivenza mediana di 24-36 mesi. Nel corso degli ultimi anni sono stati sviluppati numerosi farmaci chemioterapici e a bersaglio molecolare che hanno permesso di conseguire importanti successi nel trattamento di questa malattia, ma solo nel caso degli anticorpi monoclonali anti-EGFR sono disponibili marcatori predittivi di resistenza, utili ai fini della personalizzazione del trattamento. In particolare, le mutazioni a carico dei geni RAS o l’amplificazione del gene HER2 vengono utilizzate per individuare le neoplasie non responsive agli anticorpi anti-EGFR, ma non esistono ulteriori strumenti diagnostici che permettano di caratterizzare i tumori RAS-wild type ed HER2-negativi comunque non responsivi a questa categoria di farmaci. Sono quindi necessari nuovi marcatori biomolecolari per personalizzare la scelta dei farmaci e soprattutto per selezionale la sequenza terapeutica ottimale. Il presente progetto utilizzerà un sofisticato approccio di analisi del profilo di espressione genica e di metilazione e moderni modelli in vitro ed in vivo di CCR con il duplice obiettivo di studiare i meccanismi molecolari responsabili della farmacoresistenza e di validarne la ricaduta clinica. L’aspetto innovativo del progetto è lo studio della riprogrammazione epigenetica della cellula tumorale (profilo di metilazione) come meccanismo utilizzato nella resistenza farmacologica ed il tentativo di validare una signature di metilazione come predittiva di resistenza in clinica. Lo studio affronterà sia la resistenza ad oxaliplatino ed irinotecan, due farmaci per i quali non esistono biomarcatori predittivi, sia la resistenza agli inibitori dell’EGFR nel CCR metastatico RAS-wild type ed HER2-negativo. Infine, lo studio è rilevante nell’ottica di caratterizzare il sottogruppo di pazienti con CCR potenzialmente suscettibili di terapia con farmaci demetilanti, una classe di molecole in corso di valutazione clinica.

	N. mesi fuori sede	Costo mesi fuori sede	Costo mesi in sede	Costo totale ricercatore linea 1
1.	9	5.405,46 €	4.805,46 €	178.396,56 €
	TOTALE			178.396,56 €

MINISTERO DELL'ISTRUZIONE DELL'UNIVERSITÀ E DELLA RICERCA Dipartimento per la formazione superiore e per la ricerca Direzione Generale per il coordinamento, la promozione e la valorizzazione della Ricerca BANDO "AIM" (ATTRACTION AND INTERNATIONAL MOBILITY)

MINISTERO DELL'ISTRUZIONE DELL'UNIVERSITÀ E DELLA RICERCA
Dipartimento per la formazione superiore e per la ricerca
Direzione Generale per il coordinamento, la promozione e la valorizzazione della Ricerca
BANDO "AIM" (ATTRACTION AND INTERNATIONAL MOBILITY)